新冠病毒（SARS-CoV-2）的刺突S蛋白是介導(dǎo)其進(jìn)入宿主細(xì)胞的蛋白，也是疫苗和藥物研發(fā)的主要靶標(biāo)之一。近日，科研人員發(fā)現(xiàn)，新冠S蛋白發(fā)生在D614G位置上的氨基酸殘基突變可顯著增強(qiáng)病毒的感染能力，并且降低了病毒對患者恢復(fù)期血清的敏感性。

當(dāng)?shù)貢r間6月20日，重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點實驗室

黃愛龍團(tuán)隊在醫(yī)學(xué)預(yù)印本平臺bioRxiv上發(fā)表了題為：The D614G mutation of SARS-CoV-2 spike protein enhances viral infectivity and decreases neutralization sensitivity to individual convalescent sera 的最新研究論文，論文作者均來自重慶醫(yī)科大學(xué)，通訊作者為全國政協(xié)委員、重慶醫(yī)科大學(xué)校長黃愛龍、重慶醫(yī)科大學(xué)教授唐霓等人。

此前，黃愛龍團(tuán)隊于4月29日、6月5日和6月18日短時間內(nèi)在國際頂級期刊 《自然·醫(yī)學(xué)》（Nature Medicine）發(fā)表了三篇論文，針對新冠病毒患者的抗體反應(yīng)和無癥狀感染者的臨床和免疫學(xué)特征展開研究。

此次研究中，黃愛龍團(tuán)隊詳細(xì)闡述了新冠病毒S蛋白在614位置的顯性突變（D614G突變）。研究表明，新冠病毒所屬的RNA病毒突變率極高，這可能助長傳播和毒性。

新冠病毒S蛋白中唯一的顯著變異就是非同義D614G突變（天冬氨酸D變?yōu)楦拾彼酖）。原始數(shù)據(jù)表明，S-G614是SARS-CoV-2的致病性更高的毒株，具有較高的傳播效率。此前也有研究稱，SARS-CoV-2變體的S-G614蛋白中存在一種新的絲氨酸蛋白酶（彈性蛋白酶-2）切割位點，但是目前科研人員尚不清楚S蛋白中D614G的轉(zhuǎn)化如何影響病毒的感染性，也不清楚S-G614蛋白是否可以在細(xì)胞模型中被彈性蛋白酶-2處理和激活。

在此研究中，科研人員發(fā)現(xiàn)，D614G突變在所有分析的序列中占比高達(dá)64.6%，在全球范圍內(nèi)存在大量自然分布。

研究人員通過慢病毒表達(dá)系統(tǒng)等還發(fā)現(xiàn)，這一突變可以增強(qiáng)蛋白酶對S蛋白的切割能力，從而促使病毒具有更強(qiáng)的感染能力。

此外，D614G突變改變了S蛋白甚至是整個病毒的免疫原性，進(jìn)而降低了康復(fù)期血清對病毒的敏感性。

作者們認(rèn)為，這項研究將有助于理解SARS-CoV-2的傳播，同時推動新冠疫苗的設(shè)計和藥物研發(fā)。

D614G突變增強(qiáng)S蛋白切割能力，使病毒有更強(qiáng)感染能力

研究人員首先通過數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，S蛋白D614G突變體存在自然分布，且在全球范圍內(nèi)新冠S蛋白中觀察到的前10個最豐富的非同義突變中，D614G突變表達(dá)的相對豐度最高，這個突變在所有分析的序列中占比高達(dá)64.6%。

因此，研究人員認(rèn)為，D614G突變在新冠病毒進(jìn)化過程中可能具有選擇優(yōu)勢。而此前的研究顯示，攜帶D614G突變的新冠病毒毒株已經(jīng)取代2019年的原始毒株成為了主流新冠病毒株。根據(jù)近日公布的數(shù)據(jù)，導(dǎo)致6月北京新發(fā)地新冠疫情的病毒也均帶有D614G突變。

D614G突變?yōu)楹问剐鹿诓《居懈鼜?qiáng)感染力、更易進(jìn)入宿主？

通常來講，冠狀病毒利用兩種不同的途徑侵入細(xì)胞：一種是蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞表面途徑（protease-mediated cell-surface），另一種是胞內(nèi)體途徑（endosomal pathway）。

冠狀病毒S蛋白會被宿主細(xì)胞的蛋白酶切割成S1亞基和S2亞基，其中，S1亞基負(fù)責(zé)受體識別和結(jié)合，S2亞基負(fù)責(zé)感染過程中入侵階段的膜融合。

而通過蛋白酶切割實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)D614G這種突變引入了另外一個彈性蛋白酶2切割位點，進(jìn)而可以增強(qiáng)蛋白酶對S蛋白的切割能力，促進(jìn)了其裂解和病毒細(xì)胞的進(jìn)入。這預(yù)示著S-D614G突變體對宿主細(xì)胞，甚至是個體有更強(qiáng)的感染能力。

研究人員發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pS-G614的細(xì)胞顯示出比轉(zhuǎn)染pS-D614的細(xì)胞更強(qiáng)的S1信號，這表明D614G突變改變了細(xì)胞蛋白酶對S蛋白的裂解性。

隨后，科研人員又通過慢病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建新冠病毒突變體假病毒（含有熒光素酶報告基因），使用表達(dá)人類新冠病毒受體ACE2（293T-ACE2）的HEK293T細(xì)胞測試ACE2表達(dá)與假病毒易感性之間的關(guān)系。

研究人員發(fā)現(xiàn)，并且證明新冠病毒突變體假病毒在HEK293T細(xì)胞上的感染能力，不管從包裝效率還是感染、表達(dá)能力等方面都更加強(qiáng)勁。

在實驗中，使用攜帶G614的新冠病毒S蛋白變體，在細(xì)胞模型感染后48小時，病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)量比攜帶D614的新冠病毒S蛋白變體增加了2.2倍；此外在細(xì)胞感染S-G614假病毒后72小時，研究人員觀察到最高的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比S-D614假病毒高約2.4倍。

S-G614蛋白假型病毒顯示出感染力有所增加

這意味著，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化輸入病毒劑量時，S-G614假病毒的進(jìn)入效率是S-D614假病毒的2.4倍左右，這表明D614G突變可促進(jìn)SARS-CoV-2的感染性并增強(qiáng)病毒的傳播能力。

研究人員還指出，由于假病毒是單輪感染檢測，因此體外實驗中病毒進(jìn)入效率的這種看似很小的增加可能會導(dǎo)致體內(nèi)病毒感染性的巨大差異。

突變可使康復(fù)患者血清中和效應(yīng)大幅降低

恢復(fù)期血漿療法是一種傳統(tǒng)的輸血治療方法，在嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）、埃博拉出血熱、中東呼吸綜合征等新發(fā)突發(fā)傳染病疫情的救治中均發(fā)揮了一定作用。在此次新冠疫情期間，也有研究證明從新冠康復(fù)病人血液中提取的免疫球蛋白有更高的中和能力、更高的特異性。

對此，黃愛龍團(tuán)隊通過體外微量中和實驗，對康復(fù)者血清對突變體病毒和未突變病毒的中和能力進(jìn)行了驗證。

2020年2月5日至2月10日期間，研究人員從重慶市的三家定點醫(yī)院收集了總共41例恢復(fù)期新冠患者血清樣本（癥狀發(fā)作后2-4周），并探索它們對突變體假病毒的抑制作用。

研究者們發(fā)現(xiàn)，93％（38/41）的恢復(fù)期新冠患者血清樣本可以中和S-D614和S-G614兩種假病毒，并且具有相當(dāng)?shù)男?。但是值得注意的是，大約7％（3/41）的恢復(fù)期血清樣本顯示出對S-G614假病毒的中和活性降低。

在所有樣本中，來自1號、7號、40號病人的血清對突變體假病毒的抑制作用是降低的，而對野生型病毒的中和能力則非常強(qiáng)（甚至存在3-4倍的中和差異）。

其中，1號病人的血清對突變體假病毒完全失去了中和能力，而此前的實驗證明，它可以中和大約30%的原始病毒。

此外，上述3例患者血清樣本在ID50（半數(shù)抑制劑量，在50%的實驗動物造成感染的微生物劑量）的S-D614假病毒中顯示出894至1337的較高的中和活性，但在S-G614假病毒中，其ID50的中和活性僅為216至367，明顯有所降低。

研究人員表明，這意味著在攜帶D614G突變的新冠病毒中，康復(fù)患者血清樣本對于病毒的中和效價僅為原來的（針對未突變病毒）約四分之一。

研究人員據(jù)此得出結(jié)論：新冠病毒S蛋白的D614G突變改變了S蛋白甚至是整個病毒的免疫原性，進(jìn)而降低了康復(fù)期血清對病毒的敏感性。

研究人員最后提到，本研究設(shè)計中也存在一些限制性條件。比如實驗使用的是新冠病毒突變體假病毒，缺失S蛋白C末端第19位氨基酸；本次中和實驗主要圍繞S蛋白展開研究，相關(guān)的其他蛋白或者表位沒有考慮在內(nèi)等。

作者們指出，需要進(jìn)一步使用真正的SARS-CoV-2病毒進(jìn)行其他測定實驗，同時也應(yīng)針對D614G以外的其他病毒突變展開研究評估。