睡眠剝奪小鼠模型的建立

根據(jù)睡眠缺失的情況，一般將睡眠剝奪分為完全睡眠剝奪（TSD）和選擇性睡眠剝奪（SSD）。既往研究中TSD一般指至少24h完全睡眠缺失，SSD指睡眠時(shí)相的剝奪如REM-SD或NREM-SD。與二者相比，日常生活中人類(lèi)睡眠剝奪大多介于二者之間，尤其是住院患者、慢性疼痛及失眠人群中經(jīng)常出現(xiàn)睡眠少于6hTSD。因此，為了最大限度的模擬臨床手術(shù)患者睡眠剝奪模式，可選擇TSD剝奪模式。對(duì)于睡眠剝奪方法，以往多采用改良的多平臺(tái)法制作大鼠睡眠剝奪，此方法主要用于REM睡眠剝奪，對(duì)NREM干擾有限，而且由于掉落水中會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

參考最新TSD相關(guān)研究，在飼養(yǎng)小鼠的圓形鼠籠底部安裝可旋轉(zhuǎn)的機(jī)械裝置，其中有一根緩慢旋轉(zhuǎn)的棒產(chǎn)生輕柔、持續(xù)的機(jī)械刺激避免小鼠睡覺(jué)。此裝置去除了以往裝置中小鼠持續(xù)的強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)，減少了應(yīng)激干擾。睡眠剝奪前將小鼠放入儀器中熟悉環(huán)境24h，睡眠剝奪期間小鼠自由飲食，剝奪后在儀器中自由睡眠飲食，減少更換飼養(yǎng)環(huán)境的干擾。根據(jù)文獻(xiàn)資料設(shè)定剝奪時(shí)間為3天，每天9h（AM7:00-PM4:00）。第三天結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。為了保證此種睡眠剝奪方法的效果，首先通過(guò)給小鼠頭部置入腦電圖（EEG）/肌電圖（EMG）監(jiān)測(cè)睡眠情況，確定睡眠剝奪模型構(gòu)建成功。

- Fig1 睡眠剝奪流程示意圖 -

小鼠腦電圖（EEG）/肌電圖（EMG）置入手術(shù)

為記錄腦電圖（EEG）/肌電圖（EMG），首先用電路板及銀絲焊接自制電極，雙通道腦電與雙通道肌電。使用3vol%異氟醚誘導(dǎo)小鼠麻醉，將小鼠固定在腦立體定位儀上。在手術(shù)過(guò)程中維持吸入濃度在1.2-1.5vol%，剃除小鼠頭頸部毛發(fā)，碘伏消毒手術(shù)部位。用眼科剪從頭部開(kāi)始做一個(gè)1.0厘米長(zhǎng)的橢圓形切口（前至雙眼連線(xiàn)，后至頸部上緣），鈍性分離皮下組織，用棉簽浸潤(rùn)無(wú)菌生理鹽水剝離顱骨上粘膜及骨膜充分暴露顱骨。用顱骨鉆打孔，注意要鉆通顱骨，避免損傷硬腦膜，以免影響EEG記錄質(zhì)量。使用3顆不銹鋼螺釘（1×3mm）作為EEG電極，并植入顱骨表面（坐標(biāo)）：正極（AP:-1.0mm，ML:-1.5mm），負(fù)（AP:-2.0mm,ML:1.5mm）和參考電極（AP:-4.0mm,ML:-1.5mm），植入深度約0.5mm。將不銹鋼螺絲釘擰轉(zhuǎn)、固定在上述鉆好的顱骨孔中，深度以螺絲釘正好越過(guò)顱骨為易（螺絲紋2-3圈），出血時(shí)可用棉簽壓迫或生理鹽水沖洗。將兩條銀絲電極埋植于頸部?jī)蓚?cè)的斜方肌內(nèi)。用牙科水泥將螺絲釘固定于顱骨表面（注意不要將導(dǎo)電的銀絲覆蓋）。待牙科水泥固定后，用電烙鐵將對(duì)應(yīng)的銀絲焊接至自制的電路板，再次用牙科水泥將電路板固定于頭部。待完全固定后停止麻醉，小鼠蘇醒后放置鼠籠單獨(dú)飼養(yǎng)，術(shù)后恢復(fù)一周用于實(shí)驗(yàn)。

腦電（EEG）/肌電（EMG）圖記錄及分析

將置入腦電（EEG）/肌電（EMG）的小鼠放入睡眠剝奪儀中，經(jīng)過(guò)萬(wàn)向輪傳至前置放大器，經(jīng)放大后傳至Power Lab生理記錄儀系統(tǒng)采集腦電信號(hào)，設(shè)置采樣頻率為128Hz。信號(hào)濾波設(shè)置為：EEG，0.5—50Hz；EMG，30—300Hz。使用Sirenia Sleep Pro軟件對(duì)腦電信號(hào)進(jìn)行分析，所有腦電波均以10s為一個(gè)epoch。NREM腦電圖為低頻（0.5-4hz范圍），高振幅（+/-150-250mv）delta波，低振幅EMG波。REM腦電波以θ波為主（6-9hz范圍）、低振幅（+/-50-100mV）和平坦的混合頻率肌電圖。Wake期腦電圖為高頻（8~50Hz）、低振幅（+/-50~100mV）、高振幅肌電圖。軟件分析是半自動(dòng)化的，首先使用聚類(lèi)評(píng)分設(shè)定，根據(jù)設(shè)定條件軟件自動(dòng)掃描，根據(jù)肌電圖功率、EEG振幅和頻率將一個(gè)epoch劃分為REM、NREM或Wake狀態(tài)。自動(dòng)分析結(jié)束后對(duì)自動(dòng)掃描的epoch進(jìn)行檢查，以確保每個(gè)epoch都根據(jù)定義進(jìn)行評(píng)定，對(duì)未進(jìn)行分析的epoch則手動(dòng)根據(jù)定義評(píng)定。

- 多模態(tài)信號(hào)同步采集（EEG+ECG+EMG+體動(dòng)）-

小鼠機(jī)械痛閾值的測(cè)定

所有實(shí)驗(yàn)小鼠均在同一行為學(xué)房間進(jìn)行測(cè)試，將實(shí)驗(yàn)小鼠用有機(jī)透明玻璃觀(guān)察盒子（三面黑色，一面透明，防止小鼠之間互相干擾）隔開(kāi)，放置在金屬鐵絲網(wǎng)上，保持室內(nèi)安靜至少半小時(shí)以上，直到小鼠不在出現(xiàn)尋覓、排便等行為時(shí)開(kāi)始測(cè)定。使用標(biāo)準(zhǔn)的von Frey纖維絲測(cè)定機(jī)械痛閾，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選取測(cè)量Von Frey纖維絲分別為0.07、0.16、0.4、0.6、1、1.4和2g。將纖維絲垂直刺激小鼠的右后腳掌心，緩慢用力直到纖維絲微微彎曲（持續(xù)1-3s），當(dāng)小鼠突然回撤爪子或者舔腳掌的行為時(shí)記錄為陽(yáng)性反應(yīng)。痛閾測(cè)定時(shí)從纖維絲0.6g開(kāi)始，每個(gè)彎曲力刺激5次，三次或三次以上的陽(yáng)性反應(yīng)為陽(yáng)性結(jié)果。使用up-and-down方法記錄小鼠出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的纖維絲對(duì)應(yīng)的克數(shù)即為小鼠機(jī)械刺痛的閾值。為防止因?yàn)轭l繁刺激影響結(jié)果，每次間隔1min左右。刺激時(shí)，小鼠出現(xiàn)走動(dòng)尋覓或者刺激一接觸就出現(xiàn)提足行為時(shí)，需要等小鼠安靜下來(lái)再進(jìn)行測(cè)量。

小鼠熱刺痛閾值的測(cè)定

將實(shí)驗(yàn)小鼠用有機(jī)透明玻璃觀(guān)察盒子（三面黑色，一面透明，防止小鼠之間互相干擾）隔開(kāi)，放置在熱痛測(cè)定專(zhuān)用玻璃板上，待小鼠能靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)（不四處走動(dòng)）開(kāi)始測(cè)定。使用熱痛儀激光垂直照射小鼠的右后腳掌心，當(dāng)小鼠出現(xiàn)抬腳或者舔腳的反應(yīng)則記錄為陽(yáng)性結(jié)果，從開(kāi)始輻射熱刺激到出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)的時(shí)間為縮爪潛伏期（Withdrawal latency）。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整輻射熱源的強(qiáng)度，使正常小鼠縮爪潛伏期維持在15s左右，并設(shè)置切斷時(shí)間為30s。每只小鼠進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，每次間隔5min，三次實(shí)驗(yàn)所記錄時(shí)間的平均值即為小鼠的熱刺痛閾值。

- 大小鼠足底熱刺痛儀，型號(hào)：XR1800，上海欣軟 -

EEG/EMG記錄結(jié)果(參數(shù))

首先對(duì)旋轉(zhuǎn)棒干擾睡眠的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)睡眠剝奪實(shí)施方案，持續(xù)監(jiān)測(cè)記錄小鼠的EEG/EMG，分析判斷Wake、NREM和REM各階段的時(shí)間。與對(duì)照組相比睡眠剝奪組Wake時(shí)間明顯延長(zhǎng)，NREM和REM期幾乎被消除。其中Wake期占總時(shí)間的96.16%，NREM期占總時(shí)間的3.78%，REM占總時(shí)間的0.06%。而對(duì)照組Wake期占總時(shí)間的33.04%，NREM期占總時(shí)間的55.12%，REM期占總時(shí)間的11.84%。此種睡眠剝奪方法可使小鼠在剝奪期處于幾乎完全清醒狀態(tài)，EEG顯示隨著睡眠剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，睡眠壓力升高，小鼠進(jìn)入NREM的嘗試更多。

- Fig2 CBD增加睡眠剝奪小鼠睡眠恢復(fù)期的覺(jué)醒能力 -

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小動(dòng)物無(wú)線(xiàn)電生理記錄儀

- 純無(wú)線(xiàn)，無(wú)束縛，續(xù)航長(zhǎng)，信號(hào)穩(wěn)，體積小，重量輕 -

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