酒精使用障礙在全球范圍內極為普遍，其特征是在戒斷期間會出現(xiàn)嚴重的疼痛敏感性。

基于此，2024年9月27日中國科學技術大學生物物理與神經生物學系張智研究團隊在Science Advances雜志發(fā)表了“A neural circuit for alcohol withdrawal–induced hyperalgesia in a nondependent state”揭示了非依賴狀態(tài)下酒精戒斷引起的痛覺過敏的神經回路。

在這里，作者建立了一個在成癮之前酒精戒斷（EW）期間痛覺過敏的小鼠模型，以研究其發(fā)病窗口和潛在機制。通過體內顯微內窺鏡和雙光子鈣成像的能技術，確定了從背側海馬CA1谷氨酸能神經元（dCA1Glu）到前扣帶皮層谷氨酸能神經元（ACCGlu）的神經回路通路，該通路在EW小鼠的痛覺過敏中被激活?；瘜W遺傳學抑制這一通路可以減輕EW小鼠的痛覺過敏，而激活則在未經EW的小鼠中重現(xiàn)了EW誘導的痛覺過敏。這些發(fā)現(xiàn)表明，在小鼠對酒精產生依賴之前，dCA1Glu到ACCGlu的神經通路參與推動EW誘導的痛覺過敏。

圖一 在非依賴狀態(tài)下，小鼠的酒精戒斷誘導痛覺過敏

以前建立酒精依賴小鼠模型的方法是通過慢性間歇性酒精暴露，動物至少接受一個月（平均）的四個重復周期的酒精蒸汽暴露，或至少連續(xù)3周自由飲用液態(tài)酒精。因此，為了探索短期飲酒戒斷對小鼠疼痛敏感性的影響，作者縮短了暴露時間，建立了一個連續(xù)飲酒的小鼠模型，允許小鼠自由飲用20%的酒精兩周，每六天有24小時的戒斷期。在第二次戒酒酒精消耗后24小時，發(fā)現(xiàn)在用von Frey刺激戒酒組（EW組）小鼠右后爪時，其機械閾值顯著低于對照組小鼠。相比之下，通過Hargreaves測試評估的熱閾值在EW小鼠和對照組之間沒有顯著差異。

作者在EW期間觀察到的機械閾值降低可以持續(xù)長達3天。此外，在對照組小鼠中，機械或熱閾值沒有觀察到變化。然后作者使用曠場測試（OFT）和高架十字迷宮（EPM）測試了兩周的酒精消耗戒斷是否也伴隨著焦慮樣情感障礙，結果顯示，在進入中心區(qū)域的頻率或在OFT測試中運動的距離沒有顯著差異，在EPM測試中進入開放臂的頻率或在開放臂中花費的時間也沒有明顯差異。為了進一步測試EW小鼠是否發(fā)展為酒精依賴或保持非成癮狀態(tài)，在第二次戒斷期后兩周的酒精消耗期間，對兩組小鼠進行了偏好測試。EW組和對照組小鼠都表現(xiàn)出對蔗糖的高度偏好和對酒精的非常低的消耗，而在EW組和對照組小鼠之間，蔗糖或酒精的攝入量沒有差異，這表明EW小鼠保持了與對照組小鼠相當?shù)膶φ崽堑母叨绕?，在連續(xù)兩周的酒精消耗后，對酒精沒有明顯的偏好。

此外，作者還量化了這種范式下小鼠的酒精消耗量，發(fā)現(xiàn)兩周內酒精攝入量沒有變化。還通過收集EW小鼠的尾靜脈血測試了血漿酒精濃度，發(fā)現(xiàn)第一次和第二次戒斷后血漿酒精濃度沒有差異，這表明在連續(xù)酒精暴露后血漿酒精濃度保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。此外，血漿酒精濃度在2小時后逐漸降低，比第二次戒斷后降低明顯，并且在第二次EW后8小時無法檢測到。此外，作者發(fā)現(xiàn)EW小鼠的體重增長趨勢與對照組小鼠相比沒有差異，這表明當前研究中兩周的連續(xù)酒精暴露沒有影響小鼠的健康狀態(tài)。這些結果共同表明，兩周的酒精消耗戒斷可以在小鼠中誘導疼痛敏感化，而不是酒精依賴。

圖二 在戒酒小鼠中dCA1Glu活性增強

海馬尤其是背側CA1區(qū)域，是大腦中對酒精敏感的目標，可能涉及與急性或慢性酒精消耗或戒斷相關的疾病。為了探究dCA1在EW誘導的痛覺過敏中的作用及其機制，作者首先通過免疫熒光染色檢測這一區(qū)域的c-Fos表達，結果顯示與對照組小鼠相比，EW小鼠的dCA1中c-Fos信號顯著增強；為了測試dCA1Glu神經元的神經興奮性，在對照和EW轉基因Thy1-黃色熒光蛋白（YFP）小鼠的腦片上進行了體外電生理記錄。與對照組小鼠相比，EW小鼠的dCA1Glu神經元活性顯著升高，表現(xiàn)為放電率增加和電流誘發(fā)的動作電位的閾值降低，而靜息膜電位沒有明顯變化。此外，作者還進行了顯微內窺鏡實驗，將GCaMP 6m注射到EW和對照組C57小鼠的dCA1，以在體內直觀觀察dCA1Glu神經元活性。EW小鼠的dCA1Glu神經元的鈣活性和強度顯著高于對照組。這些結果共同揭示，在小鼠形成依賴之前，短期酒精消耗戒斷期間dCA1Glu神經元活性增加。

為了進一步探索dCA1Glu神經元如何參與疼痛敏感化，作者使用了化學遺傳學抑制EW和對照組小鼠的dCA1Glu神經元。行為測試顯示，與感染對照病毒的dCA1中的EW小鼠相比，化學遺傳學抑制dCA1Glu神經元的EW小鼠的機械閾值顯著升高，而化學遺傳抑制dCA1Glu神經元對hM4Di-對照組小鼠的機械閾值沒有影響。此外，作者還通過化學遺傳學激活了未經處理的C57小鼠的單側dCA1，在這些未經處理的小鼠中，特異性激活dCA1Glu神經元導致對側后爪的機械閾值降低，與感染對照病毒的小鼠相比，在曠場測試的總行程沒有變化。此外，根據(jù)廣泛用于評估癲癇嚴重程度的Racine量表，作者研究了行為記錄中的癲癇樣行為，如口部和面部運動、頭部點頭、前肢陣攣、站立和跌倒，而在化學遺傳學激活dCA1Glu神經元的小鼠中幾乎沒有觀察到癲癇樣行為。這些結果支持dCA1Glu神經元有助于與EW相關的痛覺過敏。

圖三 戒斷短期飲酒后，前扣帶回谷氨酸能神經元活動增強

為了直觀觀察并量化dCA1Glu神經元到ACC的投射活動，作者在ACC中注射了逆行病毒并進行了全細胞膜片鉗記錄。結果顯示，在第二次戒酒后24小時，與對照組相比，戒酒小鼠的dCA1Glu神經元的放電率升高，而電流誘發(fā)的動作電位的閾值降低。此外，在第二次戒酒后24小時，與對照組小鼠相應的神經元相比，戒酒小鼠的dCA1Glu神經元的鈣信號明顯增強。這些結果表明，在小鼠形成依賴之前，戒酒期間投射到ACC的dCA1Glu神經元活動增加。免疫熒光染色顯示，戒酒小鼠ACC中c-Fos的表達高于對照組動物。此外，在EW和對照組Thy1-YFP小鼠的腦片上進行的體外電生理記錄顯示，ACCGlu神經元的活性增強，放電率增加，電流誘發(fā)的動作電位的閾值相對于對照組小鼠降低。

為了在單細胞水平上觀察ACCGlu神經元活動的變化，作者進行了活體雙光子鈣成像，結果顯示，在第二次戒酒后24小時，ACCGlu神經元檢測到的鈣信號強度顯著增加。為了檢驗在連續(xù)短期酒精消耗后戒酒對ACCGlu神經元對機械刺激的敏感性，隨后應用光纖記錄自由活動小鼠的鈣信號，在第二次戒酒后24小時，戒酒小鼠右后爪接受0.07克von Frey細絲刺激后，ACCGlu神經元中的鈣信號迅速增加。為了進一步確定機械刺激對ACCGlu神經元活動的影響，在ACC中注射了AAV-CaMKIIα-GCaMP6m病毒的自由活動小鼠上進行活體顯微內窺鏡記錄 ACCGlu神經元的鈣信號度。結果顯示，在第二次戒酒后24小時，與對照組小鼠相比，戒酒小鼠的ACCGlu神經元的鈣信號強度顯著增加。這些結果表明，在小鼠發(fā)展成依賴之前，敏感化的ACC谷氨酸能神經元對短期飲酒戒斷后具有重要作用。

總結：

作者的研究表明dCA1Glu到ACCGlu的神經回路在促進短期酒精消耗后戒斷引起的痛覺過敏中發(fā)揮功能作用，這種非依賴性酒精消耗與疼痛敏感化的生理聯(lián)系為大腦中不同神經系統(tǒng)之間錯綜復雜的網(wǎng)絡相互作用提供了越來越多的證據(jù)，這些相互作用共同介導了酒精依賴的發(fā)展。